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2022/07/06
技术共探丨药研人都想拥有的XRD研究指南
2021年09月22日
科学原理
从古至今，与“宇宙的尽头”、“万物的起源”这类宏大的话题相对应，人类对“有关微观世界的真相”一直抱有同样的好奇心。
1895年，德国实验物理学家伦琴发现了一种具有强穿透力的未知射线，因其不确定性被命名为X-射线（X-Ray）。研究物质微观结构的第一种有效方法由此出现。
后来的人们知道，这种神秘射线是一种短波电磁辐射。证明这一结论的是同样来自德国的科学家劳厄，1912年他利用天然晶体的晶格作为衍射光栅，观察到X-射线的衍射现象。这成为X-射线衍射和晶体研究两大科学发展史上的重要里程碑，为探索物质的内在结构打开了崭新的视角。
▲凭借发现X射线在晶体中的衍射现象，劳厄获得了1914年的诺贝尔物理学奖
在劳厄发现X-射线衍射现象后，科学家们试图对这一现象的原理进行解释。最终，英国科学家布拉格父子提出了简明清晰的布拉格方程：2dsinθ=nλ，用以解释X-射线晶体衍射的形成。
▲布拉格方程示意图
延续这一思路，科学家对晶体结构做出了更多的深入研究，并将这一方法不断优化改进，采用粉末状的晶体甚至是液体，得出清晰的衍射环。
X-射线衍射法因其不损伤样品、无污染、快捷、测量精度高、获取信息量大完整等优点，迅速成为一种重要的实验方法和结构分析手段，被广泛应用于物理、化学、生物医药、地球科学、材料科学等诸多领域。
仪器应用
X-射线衍射仪(XRD) Bruker D8 advance
支持全面扩展的模块化系统，拥有易配置和可扩展两大特点。Twin-Twin双光路，搭载90位自动进样器，可高效自动化处理复杂序列。
测试可选透射、反射两种模式，满足固体（粉末、块体、薄膜）、液体、乳膏状各种衍射分析需求。
同时，仪器搭载FDA 21 CFR PART11，具有覆盖测试及数据处理的全程审计追踪，保障数据信息的安全与规范。
X-射线衍射仪（X-Ray Diffractometer）是研究物质的物相和晶体结构的主要设备。当某物质(晶体或非晶体)进行衍射分析时，该物质被X射线照射产生不同程度的衍射现象，物质组成、晶型、分子内成键方式、分子的构型、构象等决定该物质产生特有的衍射图谱。
▲X射线衍射仪工作示意图
X-射线衍射通过分析不同晶体物质的X射线衍射特征峰，完成对样品立体结构（含手性、晶型、结晶水或结晶溶剂）或成分（主成分及杂质成分、晶型种类及含量）的分析，实现有效判别晶体物质种类与含量的目的。
指导原则
当前，随着国内《药品注册管理办法》的进一步落实，发补案例越来越常见。一方面，这显示出国家对药品申报注册管理愈发严格，日益规范；另一方面，这也要求广大医药研发伙伴在药品申报前的质量研究要更加严谨专业。
例如，在某药品的发补文件中，针对晶型研究指出其水溶解性差且存在多晶型，需要对药品在不同结晶溶剂、结晶条件下晶型进行研究，并结合制剂工艺考察研磨、压力条件下晶型的稳定情况。同时，对多批样品晶型进行考察，证明现工艺得到样品的晶型一致。
在此情况下，X-射线衍射法作为药物多晶型研究的主要手段之一，成为解决如上发补难题的较优办法。X-射线衍射法贯穿在原料药研究、制剂研究等药物质量控制各个阶段，可以进行药物定性、药物定量、结晶度测试等，具有特异、准确、快速、前处理简便等优点，广泛收录于各国药典。
《中国药典》2020版四部0451专门阐述了药品研究中X射线衍射法的应用，9015则指明了药品晶型研究及晶型质量控制指导原则。美国药典（USP）941章节介绍了有关 CHARACTERIZATION OF CRYSTALLINE AND PARTIALLY CRYSTALLINE SOLIDS BY X-RAY POWDER DIFFRACTION(XRPD)。
科学原理
01. 多模式测试
聚焦光/发散光/平行光多光路选择，粉晶衍射使用发散束，为了增加受照射粉末样品量的统计性；平行光束和聚焦光束通常用于小角度掠入射，将衍射区域局限于薄膜（样品）的内部。
▲发散光-反射模式
02. 消除择优取向
由于结晶条件受到多因素的影响，粉末药物的颗粒通常会有不同的形貌，测试过程中很容易造成的较强的择优取向，毛细管-透射模式可以有效地消除择优取向。
▲同一药物在两种模式下的测试效果及其与标准谱图的对比
03. 动态光束优化
动态光束优化设计极大地提高了粉末衍射和数据统计的峰背比，可提供较好的粉末衍射数据，空气刀降低散射背景，无寄生的低角度背景散射，尤其是空气散射。
▲无空气刀
04. 荧光效应优化
样品中含有Mn、Fe、Co等元素时，会有较强的X-射线荧光效应，产生较高的背底，LynxEye一维阵列探测器具有优秀的能量分辨率及信噪比，可以有效去除样品的荧光。
▲有荧光效应
05. 谱图一致性分析（晶型一致性分析）
数据分析有三要素：峰位、峰强、峰位。
峰位（空间群，晶胞参数）
峰强（晶体结构，定量分析）
峰位（晶粒尺寸，微观应变，缺陷）
微谱数据Cluster分析功能可以从上述信息追溯同一物质不同批次的晶型一致性对比。
▲某物质多批次的晶型一致性分析
06. TOPAS(Total Pattern Analysis Solution) 谱线拟合及结构分析（包含Rietveld）
● 无需标样，不用建立校准曲线
● ZMV从晶体结构直接得到
● 同时得到微结构信息
● 多相复杂的粉末谱相定量，不因物相的增多、衍射峰重的叠而发生困难
● 择优取向、消光、线宽化，测角仪等因素引起实验强度的系统误差通过模型的修正加以校正
▲TOPAS全谱拟合定量计算
成功经验
| 研究类型 | 成功案例 |
| K值法定量 | 某无机原料药中杂质晶型的定量研究 |
| 某有机原料药中杂质晶型的定量研究 | |
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原料药 晶型研究 |
某复方胶囊制剂中API晶型鉴别 |
| 某片剂中API晶型鉴别 | |
| 某有机原料药晶型稳定性研究 | |
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