技术共探丨「新晋顶流」mRNA技术和它的Poly A尾长案例分析

疫情以来，mRNA疫苗迅速破圈走红，刮起了一场“催生新一代疗法的医学革命”。^[1]实际上，早在1960年代，科研人员就首次发现了mRNA。此后历经半个多世纪的探索，直至2020年新冠mRNA疫苗上市，这款被寄予厚望的明星产品终于走向商业化落地的初舞台。^[2]

mRNA技术大放异彩的背后，是工艺技术的大跨步进展。研究表明，核酸的Poly A结构可以让mRNA在细胞中免受核酶的降解，增强mRNA的稳定性，同时Poly A结构长度可以控制转录效率。因此，有效地检测核酸尾部Poly A的长度及不同长度A的占比是评估mRNA质量的重要指标。

随着越来越多mRNA产品的研发申报，客户对于polyA分析方法的可靠性和完成周期提出了更高的要求，这也对研究型实验室提出了更高的挑战。本期#微谱药研院·技术共探，我们将共同探讨LC-MS法检测mRNA核酸Poly A尾长的原理，以两则案例展开分析，并就常见问题给予答疑。如果还有更多疑问，欢迎文末留言讨论！

1. 方法原理

2. 案例分析

CASE 01：T1酶直接酶切，无纯化

T1酶直接酶切，前处理简单，但是杂质较多。对于碱基个数多的核酸片段，出峰时间会靠后，见图1。对单个峰进行原始质荷比图的提取，通过原始质荷比图的特征定位Poly A尾巴片段。

图1：直接酶切后的TIC图

Poly A尾巴片段的原始质荷比图为正态分布或者类正态分布，见图2。

图2：原始质荷比图

再对质谱数据进行解卷积分析可得到结果，见图3。

图3：解卷积图谱

CASE 02：T1酶切和Oligo磁珠纯化

与前面的方法相比，加入olig磁珠虽然使得前处理变复杂，成本也会相对升高，但最终呈现的效果会有明显提升，杂峰也显著减少，见图4。

图4：酶切加磁珠纯化后的TIC图

对于一个mRNA样品, 假设理论序列如图5所示。采用T1酶酶切，可能会有2段Poly A尾巴片段。但是多段尾巴可能在TIC图上是重叠的，原始质荷比图也会有所重叠，但分子量不会重叠，如图4所示，RT为8.81min的峰，其实是两段Poly A尾巴片段（碱基差异值是35A）的重叠。

图5：某个核酸的理论序列与酶切位点

2) 也可优化液相参数将两段加尾片段在UV和TIC图谱上进行分离，如图7所示。两段加尾片段的原始质荷比图和解卷积图谱见图8和图9。

图7两段加尾片段的TIC图谱

图8加尾片段1的原始质荷比图和解卷积图谱

图9加尾片段2的原始质荷比图和解卷积图谱

Poly A尾巴片段主要报告不同长度尾巴片段的占比，根据不同长度A在解卷积图谱上的响应值来计算。一般理论分子量和实际分子量的差值不超出2Da。