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2022/07/06
技术共探丨mRNA技术及其加帽率案例分析
2022年11月15日
新冠疫情的持续让 mRNA 疫苗凭借优异的技术优势登上了舞台。mRNA 疫苗将病毒 mRNA 作为抗原导入体内，刺激机体产生免疫反应。与传统疫苗相比，mRNA 疫苗具有安全、高效、易生产的优点，并且以极高的保护率成为所有新冠疫苗种类中热度极高的C位之选。
研究表明 mRNA 5’-cap 结构对于 mRNA 发挥作用是至关重要的，没有 5’-cap 的 mRNA 不能被真核起始因子4E 识别，并且 5’-cap 的存在可以保护 mRNA 5’ 端免受核酸外切酶的降解从而影响 mRNA 的稳定性[1]。因此，检测 mRNA 加帽率毫无疑问成为 mRNA 生产工艺质量分析里面最关键的指标之一。
我国国家药监局药审中心发布的《新型冠状病毒预防用 mRNA 疫苗药学研究技术指导原则（试行）》[2]中明确对 mRNA 加帽率提出要求。客户对于 mRNA 加帽率分析方法的可靠性和完成周期有了更高的期待。本期#微谱药研院·技术共探，我们将一起探讨LC-MS法检测 mRNA 加帽率的原理，以两则案例展开分析，并就常见问题给与答疑。欢迎文末留言讨论。
01：方法原理
首先设计与 mRNA 5’ 端互补的 RNA/DNA 引物探针，探针由两部分序列组成：2’-O-甲基修饰的短 RNA 序列和末端用于引导 RNase H 切割的4-6个DNA 序列。通过梯度退火使引物探针与目标 mRNA 结合，使用链霉亲和素C1磁珠提取目标物，随后利用RNase H在特定的位置进行切割从而将帽子从 mRNA 上酶切下来，最后更换溶剂条件解开引物与 mRNA 5’ 端的结合并回收核苷酸片段，通过LC-MS进行 mRNA 加帽率分析。
02：案例分析
案例一
该分析方法中所用的 RNase H 酶是一种核糖核酸内切酶，能够特异性地降解 RNA-DNA 杂合体的 RNA 链，但 RNase H 酶切割位点的专一性不稳定，除了产生预期的寡核苷酸片段外，可能还会产生其他切割位点的寡核苷酸片段。影响 RNase H 酶切割位点专一性的因素包括探针的长度、RNA中尿嘧啶的修饰等[3]。在这则案例中，除了预期的寡核苷酸片段外，还存在 RNase H 其他位点的切割产物，依赖于质谱的高分辨率，我们也能将其区分开来。
样品信息：
加帽后 mRNA 5’ 序列如下：m7GpppmGGGAGAC***UUGCUUCUG
探针序列：/BioTEG3/mCmCmCmUmCmUm***mGmUmAmAmAmCdGdAdAdGdAdC（其中m代表甲基化，d代表DNA）
单探针设计有可能会产生多个酶切位点，对加帽率的准确性带来一定的挑战。如下文所示
实验步骤：通过退火将 RNA/DNA 引物探针与目标 mRNA 结合，使用 Dynabeads™MyOne™ 链霉亲和素 C1 磁珠提取目标物，再使用 RNase H 酶切并回收核苷酸片段，通过Waters的ACQuity H-class Plus Xevo G2-XS Qtof 搭配ACQUITY Premier Oligonucleotide C18色谱柱对目标 mRNA 进行分析。数据处理软件为UNIFI。
实验结果及分析：图1为样本的 TIC 图，图中最高峰为引物探针峰，因为在前处理过程中为了确保所有 mRNA 都与引物结合，实验加入了过量的引物。相邻峰为样品峰，对其进行解卷积可得到图2的结果。在图2中我们可以明显观察到不同酶切位点的Cap1所对应的峰值，丰度最高的9587.15058对应于酶切位点3所产生的Cap1峰，9281.90878对应于酶切位点2所产生的Cap1峰，9907.00309对应于酶切位点3产生的Cap1峰，不同酶切位点所产生的加帽 mRNA 片段可以使用LC-MS区分开来。
△ 图1 样本TIC图
△ 图2 样本解卷积图
mRNA加帽率计算
根据理论分子量匹配对应的Uncapped triphos、Uncapped Diphos、Uncapped Monphos、G Cap、Cap0、Cap1、Cap1 triphos、Cap1 Diphos、Cap1 monphos，并计算其峰面积占比。
Cap1加帽率= Cap1峰面积占比 Cap加帽率= Cap0峰面积占比+ Cap1峰面积占比+ G Cap峰面积占比 对不同酶切位点产生的加帽 mRNA 片段进行加帽率分析，结果如下表：
如上表所示，实验产生了至少3个不同酶切位点的数据，不同位点的加帽率比例是有所不同的，因而对实验结果的准确性造成了一定的影响。
因此，对于LC-MS法检测加帽率的实验，可根据目标序列的特点，分别设计合成不同长度的探针序列，介导 RNase H 酶对靶标 mRNA 5’ 端短序列进行切割，从中筛选找到能够产生高比例单一位点切割片段的 RNase H 探针序列，如案例二所示。
案例二
样品信息：mRNA 5’序列如下：m7GpppmGGGAUAAUACUAGUC***GAGAGAAGCCGCCACCAUGUUC一共设计了三种长度的探针，序列如下，其中m代表甲基化，d代表DNA
探针1：/BioTEG3/mCmCmCmUmAmUmUmAmU***mAmAmGmAmCdCdAdGdGdGdG
探针2：/BioTEG3/mCmCmCmUmAmUmUmAm***AmGmAmCmCmAmGmGmGmGdTdGdTdCdTdG
探针3：/BioTEG3/mCmCmCmUmAmUmU***GmUmCmUmCmUmCmUmUmCmGmGmCdGdGdTdGdGdT
检测目的及实验过程:设计不同长度的 RNA/DNA 引物探针与目标 mRNA 序列结合，通过梯度退火使引物探针与目标 mRNA 结合。使用Dynabeads™MyOne™ 链霉亲和素C1磁珠提取目标物，再使用 RNase H 酶切并回收核苷酸片段，最后对目标 mRNA 洗脱，对释放的5'端寡核苷酸进行 mRNA 加帽率分析。使用的分析仪器为 Waters 的ACQuity H-class Plus Xevo G2-XS Qtof，搭ACQUITY Premier Oligonucleotide C18色谱柱。采集的质谱数据通过UNIFI软件进行分析。
实验结果及分析:三种不同长度的探针中产生更高比例单一位点切割片段的为探针1。图3为使用探针1获取的核苷酸片段进样所得的TIC图，保留时间7.92min所对应的峰为样品峰。通过磁珠纯化后的样本比较干净，几乎无杂峰。
△ 图3 样本TIC图
对质谱数据进行解卷积分析，通过UNIFI 软件进行匹配，匹配结果如图4所示。在加帽反应后，除了产生Cap1外也会生成其他加帽产物，如图4所示的Cap0等。从图中可以观察到使用探针1所产生的酶切位点专一性较高。
△ 图4 解卷积后谱图
对数据进行加帽率分析，结果如下表：
设计合适的引物探针有利于 RNase H 酶切位点的专一性，可增加加帽率数据分析的可信度。在合适探针的辅助下，采用 RNase H 酶切方式获得5’ 端加帽或不加帽的寡核苷酸序列，随后通过LC-MS分离不同大小的寡核苷酸片段，从而评估 mRNA 的加帽率是可行的。
03:常见问答
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